中国科学院微生物研究所向华研究员团队的文章“Reprogramming the endogenous type I CRISPR-Cas system for simultaneous gene regulation and editing in Haloarcula hispanica”于2022年3月17日在mLife 正式上线。

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https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/mlf2.12010

导读

目前已知CRISPR-Cas系统分为６种类型，其中Ｉ型系统分布最广、数量最多。基于I型系统开发基因组编辑和基因调控工具，对于认识、开发和利用功能多样的微生物或微生物菌群资源具有极其重要的意义。过去利用I型系统进行基因组编辑需要Cas3蛋白，而对靶基因进行转录调控又需要敲除cas3基因，两套系统无法兼容。中国科学院微生物研究所向华研究员团队对I型CRISPR-Cas系统功能进行了深入系统的研究，发现仅通过改造spacer长度，在不敲除cas3的情况下，利用I型系统可同时实现基因组编辑和基因转录调控。

背景介绍

微生物研究所向华研究员团队对Ｉ型CRISPR-Cas系统从病毒高效获取新spacer的引发适应机制、异已区分机制、定点整合机制等有长期系统的研究。在此过程中，不仅发现了其spacer长度的多样性，还发现改变spacer长度对引发适应和干扰具有不同程度的影响，显示出Ｉ型CRISPR-Cas系统突出的鲁棒性和可塑性。特别值得强调的是，向华/李明团队近期在I-B型CRISPR-Cas系统基因簇内部发现了其前所未见的RNA型护卫系统CreTA，提示了Ｉ型CRISPR-Cas系统对内源性CreTA基因的天然调控机制。其中抗毒素CreA具有crRNA类似结构，可以引导Ｉ型CRISPR-Cas系统效应复合物Cascade靶向结合到毒素CreT的启动子区，从而抑制毒素的表达而不切割靶标基因（Science, 2021, 372(6541): eabe5601），暗示通过改变crRNA长度或结构，在不敲除cas3的情况下，也能实现基因表达调控。基于上述启示，该团队系统研究了spacer长度对CRISPR-Cas系统干扰、引发适应和基因转录抑制功能的影响，并通过改造spacer长度，利用I型CRISPR-Cas系统同时实现了基因组编辑和基因转录调控。

科学发现

本研究以西班牙盐盒菌的I-B型CRISPR系统为研究对象，系统研究了spacer长度对CRISPR功能的影响，包括干扰、引发适应和基因转录调控。当spacer长度从36bp缩短至30bp，CRISPR表达质粒的转化效率提高了3个数量级，表明质粒干扰现象消失。进一步以蕃茄红素合成必须基因crtB为靶基因，发现在一定范围内改变spacer的长度（16-30bp），可以下调crtB基因的表达（菌落由红变白，转录降低）（图1）。

图1 改变spacer长度实现对crtB基因的转录调控

(A)(C)西班牙盐盒菌DF60(WT)及其敲除CRISPR序列的菌株（ΔCR），转化不同长度spacer表达质粒的转化子的颜色。(B)(D)荧光定量PCR测定crtB基因表达水平。pWL502为空质粒对照。

为精细评价spacer在16-30bp范围的功能效应，该团队通过全基因组深度测序和生长曲线测定，发现当spacer长度为28bp及以上时，靶基因仍有部分切割并且影响菌株的生长。但当spacer长度缩短至24bp，引发适应消失，靶基因的切割现象也消失（图2）。因此对于该菌，24bp是一个可安全用于基因调控的spacer长度。

图2　确定24bp是转录抑制的安全spacer长度

(A) PCR测定不同spacer长度表达质粒的转化子中靶序列的完整性。(B) 全基因组测序分析靶序列及其上下游各50kb区域的完整性。红色箭头指向靶序列位置。pV10C为对照质粒。(C) 测定生长曲线。

基于以上研究，该团队系统深入地揭示了spacer长度对CRISPR-Cas功能的调节作用并确定了功能调节关键边界。对于该菌而言，36bp是其典型spacer长度，可用于基因组编辑；小于等于24bp的spacer则可以引导Cascade结合靶基因而又不激发干扰和适应，可用于基因表达调控。为验证上述理论，该团队构造了质粒pDSBE，通过设计不同长度的spacer靶向不同基因，首次利用I型系统同时实现了靶基因的编辑（cdc6E精准敲除）和转录调控（crtB抑制）（图3）。

图3 利用I型系统同时进行基因编辑和基因转录调控

pDSBE质粒表达mini-CRISPR序列。U和D分别为cdc6E基因上下游同源臂。

总结展望

本研究揭示了spacer长度对I型CRISPR-Cas系统适应、干扰和转录抑制功能的调节，并基于此机制仅通过改变spacer长度，同时实现了基因组编辑和基因转录调控。I型系统是目前发现分布最广泛的CRISPR系统，本研究揭示的机制和提出的基因编辑与调控策略，有望推广至更广泛的拥有内源性CRISPR系统的微生物类群，为包括众多工业与环境微生物、病原菌在内的模式菌或非模式菌提供了一种简便高效的基因编辑和调控策略。

作者信息

第一作者

杜开心

作者单位：中国科学院微生物研究所

作者职称：硕士研究生

作者简介：2017级硕士，研究方向为CRISPR-Cas系统的遗传机制。

通讯作者

龚路遥

作者单位：中国科学院微生物研究所

作者职称：特别研究助理（博士后）

作者简介：2020年于中国科学院大学（中国科学院微生物研究所）获博士学位，现任向华研究组特别研究助理，研究方向为微生物免疫及基因组编辑工具开发。博士在读期间，获中国科学院院长优秀奖、博士研究生国家奖学金等多个奖项。博士后期间入选中国科协青年人才托举工程项目。相关工作以第一作者或共同一作在Nucleic Acids Res、Science等专业期刊上发表。

通讯作者

向华

作者单位：中国科学院微生物研究所

作者职称：研究员，教授

作者简介：中国科学院微生物研究所副所长，微生物资源前期开发国家重点实验室主任，国家杰出青年科学基金获得者，国家重点研发计划项目首席科学家。兼任中国微生物学会秘书长、中国遗传学会微生物遗传专业委员会主任，中国生物工程学会合成生物学专业委员会副主任等；现任Front Microbiol、Front Genome Edit、mLife等期刊副主编，J Genet Genomics、Biology等期刊编委。致力于极端环境微生物遗传与生理代谢、基因组编辑与合成生物学以及极端环境微生物组等研究，相关工作已在Science、Cell、Nat Commun、Nucleic Acids Res、Cell Rep、Biomaterials、Environ Microbiol等专业期刊发表论文130余篇